實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

親和層析法純化的二抗

用親和層析法純化的抗體是指，利用耦聯(lián)到瓊脂糖凝膠上的抗原將抗血清中的抗體親和層析下來。我們采用一種*的連續(xù)的洗脫過程將抗體從固態(tài)抗原上分離出來。我們提供的未標(biāo)記的親和層析法純化的抗體是不含有穩(wěn)定劑和防腐劑的無菌液體。耦聯(lián)標(biāo)記物的抗體是凍干粉，里面含有穩(wěn)定劑和防腐劑，但是過氧化物酶標(biāo)記的抗體里面不含防腐劑。  

親和層析純化抗體的選擇和定位

*步： 選擇 Whole IgG 、 F(ab ’)2 片段，或者 Fab 片段抗體。 
我們提供三種親和純化的二抗： Whole IgG ， F(ab ’)2 片段， Fab 片段。  

Whole IgG 抗體是從抗血清中分離出來的完整的分子。這些抗體有一個 Fc 部分和兩個與抗原結(jié)合的 Fab 部分，因此是二價的（圖 1 ）。它的平均分子量約為 160KD ， Whole IgG 抗體適用于多數(shù)情況，也是的。

F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶消化 IgG 去除 Fc 部分，剩下兩個靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的 Fab 部分，依然是二價的。（圖 1 ）這抗體用在特定的情況中，例如避免抗體與 Protain A 或 G 結(jié)合，或者與有 Fc 受體的活細(xì)胞結(jié)合。但是，如果一抗是 whole IgG ，不管二抗是哪種形式都可能出現(xiàn)結(jié)合 Fc 受體。這時，為了阻止抗體結(jié)合到 Fc 受體上，可以在 4 度將細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)于含有疊氮鈉和二抗來源物種正常血清的緩沖液中。

注意：當(dāng)使用的是帶標(biāo)記的二抗時，千萬不能用一抗來源物種的正常血清和 IgG 來封閉。如果血清中的免疫球蛋白非特異性的結(jié)合到樣品上，他們會被帶有標(biāo)記的二抗識別，導(dǎo)致背景過高。

牛血清白蛋白（ BSA ）和奶粉是zui為常用的封閉液，它們可能含有 IgG, 除了?？寡?/span> IgG 外，許多二抗如抗牛，抗山羊，抗綿羊與牛 IgG 有較強(qiáng)的反應(yīng)。因此，使用 BSA 或奶粉封閉或稀釋抗體會增加背景或降低抗體效價。推薦用來自二抗的物種的正常血清（ 5% v/v ）封閉。

 Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的。這些抗體只含有一個結(jié)合位點（圖 1 ）。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物種來源的一抗作多標(biāo)記的實驗中，用于封閉暴露的免疫球蛋白。而二價的抗體（ whole IgG 或 F （ ab’ ） 2 片段）不能用來封閉，因為它們有二個結(jié)合位點。封閉后，一些結(jié)合位點可能為暴露出來，與一抗結(jié)合，從而導(dǎo)致高的背景或假陽性標(biāo)記。

第二步： 在左邊標(biāo)記“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來源。

抗體是根據(jù)一抗的物種來源的字母表順序排列。比如，如果一抗是小鼠來源的，就找“ anti-mouse ”。

說明：目錄中提供了抗敘利亞倉鼠和抗亞美尼亞倉鼠的抗體。為了正確的選擇二抗，必須知道一抗是在哪種倉鼠中制備的。

第三步： 在標(biāo)有“ Host ”這一欄中選擇二抗的物種來源。

二抗的物種來源在抗體描述的開始部分，選擇二抗的物種來源應(yīng)考慮幾點: 1) 個人的取向或經(jīng)驗。 二抗的質(zhì)量問題與物種特異性沒有關(guān)系。2 ）與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合。兔抗體能很好地與蛋白A 和蛋白G 結(jié)合，但羊和猴抗體能更好的與蛋白G結(jié)合。 3 ）經(jīng)物種吸附處理的抗體可用性。某些物種來源的抗體可能不能被具有交叉反應(yīng)的物種進(jìn)行吸附處理。選擇經(jīng)過吸附處理的物種。4 ）物種兼容性。 在多標(biāo)記實驗中，一些物種不能和其他物種兼容。一般地，多標(biāo)記二抗必須來自同一物種。

第四步： 在“ antibody description ” 下面選擇二抗的特異性。

下面詞語的解釋將對選擇合適的抗體有所幫助。

注意：不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗體的生成過程也相似?？挂粋€物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)， 除非特異性的經(jīng)過交叉反應(yīng)物種的吸附處理。在抗體描述中，經(jīng)過其他物種的吸附處理的抗體標(biāo)有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

Anti-IgG (H+L)

這類抗體和 IgG 分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，比如，和 IgG 分子的 Fc ， F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族（ IgM ， IgA ，IgD,IgE ）和亞家族反應(yīng)，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈（或者 κ 鏈，或者 λ 鏈）。 Anti-IgG (H+L) 抗體比只抗片段的抗體識別更多的抗原表位，適合普通的免疫檢查過程。

Anti-IgG ， Fc/ Fc γ fragment specific

這類抗體和 IgG 重鏈的 Fc 部分反應(yīng)。它們通過 ELISA 檢測，和 / 或針對 Fab 片段吸附測試。某些情況下，這類抗體需要額外檢測和 / 或吸收處理來降低 IgM 和 或 IgA 的交叉反應(yīng)。在這種情況下（ 抗人，抗鼠和抗大鼠 ），抗體標(biāo)有“抗IgG （ Fc γ ）”，表示這類抗體只與 IgG 重鏈反應(yīng)，通常不能和 IgA 或 IgM 任何表位反應(yīng)。

注意：不是所有 anti-IgG, Fc 抗體和所有亞型的 IgG 反應(yīng)能力一致。要找和四種 IgG 亞類反應(yīng)能力差不多的 抗鼠IgG, Fc γ抗體的話，應(yīng)當(dāng)選羊抗鼠IgG( 亞類1+2a +2b+3), Fc γ特異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

Anti-IgG ， F(ab ’)2 fragment specific

這類抗體和 IgG 的 F(ab ’)2/Fab 部分反應(yīng)。它們經(jīng)過了 ELISA 和 / 或 Fc 片段的吸附檢測。它們不是特異性 IgG ，因為它們是和輕鏈反應(yīng)的，它們同時也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白（ Ig D, IgM, IgA 和IgE ）和亞類反應(yīng)。

(min X …Sr Prot)

與一個物種反應(yīng)的二抗可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非這類抗體經(jīng)過其他物種的吸收實驗。這類抗體經(jīng)過了檢測，以及針對 IgG 和圓括號中的物種的血清蛋白的吸附處理。 （標(biāo)有“ (min X…Prot)” 字樣的抗體是經(jīng)過了圓括號中所標(biāo)的物種的 IgG 和 / 或血清蛋白的吸附處理的）。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時，推薦使用這類抗體。但是，當(dāng)要選擇經(jīng)過針對相近物種吸附處理的抗體時，要特別注意，因為它們能識別的表位數(shù)量大大減小了，可能識別單抗的能力很弱。例如，在含有內(nèi)源性免疫球蛋白的大鼠的組織樣本中，只用經(jīng)大鼠 IgG 吸附處理的抗鼠 IgG 檢測大鼠組織中的鼠源一抗，或者在多標(biāo)記實驗中使用了大鼠的一抗。另個一個例子是抗大鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗敘利亞倉鼠 IgG （ min X….Mouse, Rat Sr Prot ）。

實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

以下是圓括號中所使用的一些簡稱：

Bov = Bovine
      Ck = Chicken
      Gt = Goat
      GP = Guinea Pig
      Sy Hms = Syrian Hamster
      Hrs = Horse
      Hu = Human
      Ms = Mouse
      Rb = Rabbit
      Shp = Sheep
      Sw = Swine
      Sr = Serum
      Prot = Protein.

ML （ Multiple Labeling ）

有些抗體標(biāo)明了“ ML ” ，來強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo)，還可用于多標(biāo)記實驗。

抗亞美尼亞倉鼠IgG 和抗敘利亞倉鼠IgG

大部分倉鼠單克隆抗體是來原于亞美尼亞倉鼠的脾臟細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞的雜交瘤細(xì)胞，它是亞美尼亞（而不是敘利亞）倉鼠IgG. 許多商業(yè)化的多克隆抗倉鼠IgG 是抗敘利亞倉鼠IgG, 這種抗體在檢測亞美尼亞倉鼠IgG 單克隆抗體時，它的效果沒有抗亞美尼亞倉鼠IgG 好。

注意：抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識別所有的亞美尼亞倉鼠單克隆抗體，因為它經(jīng)相近物種的吸附處理過（粗體字）。因此，使用經(jīng)過少數(shù)物種或少數(shù)相近物種的吸附處理過的抗體可達(dá)到較好的效果，如抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外，在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應(yīng)該檢測亞美尼亞倉鼠單抗。

第五步： 從表格頂部選擇需要的探針。

關(guān)于探針的技術(shù)信息參考其他網(wǎng)頁。

第六步： 在 antibody description 一行和探針欄相交處，找到選擇的抗體的價錢、規(guī)格和目錄號。

每個方格頂部的數(shù)字是每單位的價錢，底部的 9 位數(shù)字為目錄號。

第七步： 以定購目的查看產(chǎn)品說明

為了避免錯誤，產(chǎn)品說明應(yīng)該遵循一個特定的語法排列。比如，目錄號為 115 － 096 － 072 的產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)描述為：

FITC-conjugated  |	AffiniPure |	F(ab)2 fragment  |	of Goat |	Anti-Mouse  |	IgG, F(ab)2 fragment specific  |
A	B	C	D	E	F
(minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins)  |
G

A.       耦聯(lián)的探針說明，如熒光素，酶，生物素等。如果抗體沒有耦聯(lián)，不用寫。

B .      抗體純化是商標(biāo)名字，是指從抗血清中通過偶聯(lián)瓊脂糖的抗原免疫層析的方法分離得到的抗體。

C ．抗體的形式－ 完整IgG, 或者 F(ab ’)2 、 Fab 片段。

D.      抗體來源物種名稱。

E ．     和該抗體反應(yīng)的物種名稱。

F.     抗體特異性描述。

G.      經(jīng)過吸附處理以后減小了交叉反應(yīng)的物種名稱。  

實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

 

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